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96T 人(Human)內皮型一氧化氮合成酶(eNOS)ELISA 檢測試劑盒說明書

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 人(Human)內皮型一氧化氮合成酶(eNOS)ELISA 檢測試劑盒
本試劑僅供研究使用  標本:血清或血漿


試驗原理:
eNOS試劑盒是固相夾心法酶聯免疫吸附實驗(ELISA).已知eNOS濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內進行檢測。先將eNOS和生物素標記的抗體同時溫育。洗滌後,加入親和素標記過的HRP。再經過溫育和洗滌,去除未結合的酶結合物,然後加入底物A、B,和酶結合物同時作用。產生顏色。顏色的深淺和樣品中eNOS的濃度呈比例關係。

試劑盒內容及其配製:
試劑盒成份 96孔配置 48孔配置
96/48人份酶標板 1塊板(96T) 半塊(48T)
塑料膜板蓋 1塊 半塊
標準品:80umol/L 1瓶(1.0ml) 1瓶(0.5ml)
空白對照 1瓶(1.0ml) 1瓶(0.5ml)
標準品稀釋緩衝液 1瓶(8.0ml) 1瓶(4.0ml)
生物素標記的抗eNOS抗體 1瓶(8.0ml) 1瓶(4.0ml)
親和鏈酶素-HRP 1瓶(12ml) 1瓶(6.0ml)
洗滌緩衝液 1瓶(20ml) 1瓶(10ml)
底物A 1瓶(6.0ml) 1瓶(3.0ml)
底物B 1瓶(6.0ml) 1瓶(3.0ml)
終止液 1瓶(6.0ml) 1瓶(3.0ml)

 人(Human)內皮型一氧化氮合成酶(eNOS)ELISA 檢測試劑盒自備材料:

1. 蒸餾水。
2. 加樣器:5ul、10ul、50ul、100ul、200、500ul、1000ul。
3. 振蕩器及磁力攪拌器等。
4. 
樣品收集、處理及保存方法:

1、 血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內毒素的試管。收集血液後,1000×g離心10分鍾將血清和紅細胞迅速小心地分離。
  
2、 血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用於檢測。1000×g離心30分鍾去除顆粒。
3、 細胞上清液---1000×g離心10分鍾除顆粒和聚合物。
4、 組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鍾,取上清液
5、 保存------如果樣品不立即使用,應將其分成小部分-70 ℃保存,避免反複冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒,檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍並確保樣品均勻地充分解凍。

操作注意事項:

? 試劑應按標簽說明書儲存,使用前恢複到室溫。稀稀過後的標準品應丟棄,不可保存。
? 實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中,密封保存,以免變質。
? 不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。
? 使用一次性的吸頭以免交叉汙染,吸取終止液和底物A、B液時,避免使用帶金屬部分的加樣器。
? 使用幹淨的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒裏的各種成份及樣品。
? 底物A應揮發,避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感,避免長時間暴露於光下。避免用手接觸,有毒。實驗完成後應立即讀取OD值。
? 加入試劑的順序應一致,以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。
? 按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。


安全性:

1. 避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體,請盡快用水衝洗。
2. 實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
3. 不要用嘴吸取試劑盒裏的任何成份。

試劑的準備:

1. 標準品:標準品的係列稀釋應在實驗時準備,不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行:
80
 umol/L (6號標準品) 原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。
40
umol/L (5號標準品) 100ul的原倍標準品加入100ul的標準品稀釋液
20
umol/L (4號標準品) 100ul的5號標準品加入100ul的標準品稀釋液
10
umol/L (3號標準品) 100ul的4號標準品加入100ul的標準品稀釋液
5.0
umol/L (2號標準品) 100ul的3號標準品加入100ul的標準品稀釋液
2.5 umol/L (1號標準品) 100ul的2號標準品加入100ul的標準品稀釋液
0 umol/L (空白對照) 原始濃度不用稀釋直接加入50ul。

2. 洗滌緩衝液(50×)的稀釋:蒸餾水50倍稀釋。

 人(Human)內皮型一氧化氮合成酶(eNOS)ELISA 檢測試劑盒試劑盒性能:

1. 靈敏度:zui小的檢測濃度小於1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關係數R值為0.990。
2. 特異性:不與其它細胞因子反應。
3. 重複性:板內、板間變異係數均小於10%。

  
操作步驟:

1. 使用前,將所有試劑充分混勻。不要使液體產生大量的泡沫,以免加樣時加入大量的氣泡,產生加樣上的誤差。
2. 根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數。每個標準品和空白孔建議做複孔。每個樣品根據自己的數量來定,能使用複孔的盡量做複孔。
3. 加入稀釋好後的標準品50ul於反應孔、加入待測樣品50ul於反應孔內。立即加入50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板,輕輕振蕩混勻,37℃溫育45分鍾。
4. 甩去孔內液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍幹。重複此操作4次。如果用洗板機洗滌,洗滌次數增加一次。
5. 每孔加入100ul的親和鏈酶素-HRP,輕輕振蕩混勻,37℃溫育30分鍾。
6. 甩去孔內液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍幹。重複此操作4次。如果用洗板機洗滌,洗滌次數增加一次。
7. 每孔加入底物A、B各50ul,輕輕振蕩混勻,37℃溫育5分鍾。避免光照。
8. 取出酶標板,迅速加入50ul終止液,加入終止液後應立即測定結果。
9. 在450nm波長處測定各孔的OD值。

結 果 判 斷 與 分 析:

1、儀器值:於波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值
2、以吸光度OD值為縱坐標(Y),相應的eNOS標準品濃度為橫坐標(X),做得相應的曲線,樣品的eNOS含量可根據其OD值由標準曲線換算出相應的濃度, 再乘以稀釋倍數;或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數,即為樣品的實際濃度。
3、檢測值範圍:0-80umol/L
4、敏感度: 0.1 umol/L


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